Hovedvægten i Middelfart Museums ældre samlinger ligger på købstadskultur og landbokultur i 1800-1900-tallet. Middelfart by og nærmeste omegn er rigest repræsenteret, men der er indsamlet fra hele ansvarsområdet. Museet står stærkt inden for områder som købstadens liv, institutioner og kultur, primært borgerkulturen før 1940, samt inden for områderne tekstiler, dragt og beklædning frem til nyere tid (1970erne), industri, Den Gamle Lillebæltsbro og udvalgte genstandsområder fra den gamle bondekultur samt de lokale bierhverv som frugtavl, humle- og tobaksdyrkning.
I 1999 indgik samlingen fra det gamle sindssygehospital i museet. I 1992 blev Middelfart byarkiv, stiftet 1955, lagt under Middelfart Museum med sine samlinger af arkivalier og billeder. I 2005 blev Arbejderbevægelsens Arkiv lagt ind under museet.
Siden 2013 har Middelfart Museum haft psykiatrihistorien som et særligt fokusområde. Museets forskning og indsamling i dette emne rækker dermed ud over det lokale område. I 2014 har museet overtaget de psykiatrihistoriske samlinger i Augustenborg og Egebæk-Hviding. Disse samlinger skal fremover indgå i udviklingen af et nyt museum for psykiatriens historie, MIND, der skal opbygges i Middelfart.